线粒体功能的下降是衰老和年龄相关疾病的基础，但线粒体功能下降的机制以及线粒体DNA（mtDNA）突变在这些过程中的作用仍不明确。为了研究mtDNA突变的模式，在单细胞水平上量化mtDNA突变及其相关的致病效应尤为重要。然而，现有的单细胞mtDNA测序方法存在成本高和低mtDNA靶向率的问题，极大的限制了此方向的研究。

近期，康奈尔大学顾正龙教授（现就职于粤港澳大湾区精准医学研究院（广州））团队在PNAS期刊上在线发表了题为“High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level”的研究论文，通过使用自主开发的低成本的单细胞mtDNA深度测序技术（scSTAMP，多重探针靶向扩增的单细胞mtDNA测序）对健康老年个体的B淋巴细胞及单核细胞进行单细胞mtDNA深度测序，首次揭示老年个体体细胞中mtDNA突变具有远高于预期的高频性、有害性及异质性，为衰老过程中线粒体功能下降现象提供了新的机制解释，并为衰老及相关疾病的干预及治疗提供了新的研究方向。

为更准确地评估细胞内mtDNA突变率及其对细胞功能的影响，研究团队首先基于基于前期自主开发的STAMP (Sequencing by Targeted Amplification of Multiplex Probes)技术，开发了低成本的单细胞mtDNA靶向测序技术（scSTAMP）（图1）。基于该技术平台，研究团队获取了同一受试者的24 个B淋巴细胞（代表淋系）和24个单核细胞（代表髓系），将其裂解液分成两份，分别进行文库构建及深度测序，发现两者之间的突变谱具有高度的一致性，成功验证了scSTAMP技术检测单细胞水平mtDNA突变的可靠性。

 图1 单细胞mtDNA靶向测序技术（scSTAMP）的技术原理

进一步系统探究老年个体细胞中mtDNA的突变图谱，并评估mtDNA突变对细胞功能的潜在影响，研究团队运用scSTAMP技术对来自一名76岁捐献者的各768个B淋巴细胞及单核细胞进行了超高深度（平均测序深度大于640X）mtDNA测序。研究团队在这些B淋巴细胞的416个mtDNA位点中鉴定到了473个突变频率超过20%的突变，而在这些单核细胞的439个mtDNA位点中鉴定到了503个突变频率超过20%的突变，平均每个B淋巴细胞和单核细胞中存在0.658个和0.712个高频mtDNA突变位点。进一步分析发现，318个（50.3%）B淋巴细胞及346个（56.1%）单核细胞中至少具有一个高频mtDNA突变（>20%）。有趣的是，绝大多数B淋巴细胞（93.8%）和单核细胞（90.2%）中检测到的mtDNA突变位点都只出现了一次，说明老年个体体细胞的mtDNA突变具有高度的细胞间异质性及随机性。同时，还发现24.3%的B淋巴细胞和17.5%的单核细胞具有至少一个突变频率高于90%的高频突变位点（图2）。上述结果表明，高频mtDNA突变在衰老个体的B细胞和单核细胞中广泛存在。

图2  B细胞和单核细胞中存在广泛的mtDNA突变

在上述研究基础上，研究团队对鉴定到的单细胞mtDNA突变进行了深入研究，发现90%以上的mtDNA突变均定位于蛋白编码基因及tRNA基因区，且定位于蛋白编码基因的mtDNA突变中，绝大部分（>75%）均为非同义突变。为进一步评估上述mtDNA突变的有害性，研究团队利用CADD (The Combined Annotation Dependent Depletion scores)数据库，发现B细胞中的52.2% 的错义突变及单核细胞中 59.6%的错义突变的分值均大于20，表明这些mtDNA突变具有较高的致病性，提示细胞内广泛的mtDNA突变有可能显著影响线粒体的功能，促进细胞及个体的衰老。总而言之，本研究成功开发了低成本的单细胞mtDNA测序技术，并基于该技术绘制了老年个体的B细胞及单核细胞的mtDNA突变谱，发现老年个体的体细胞中mtDNA突变极为普遍，且具有高度的异质性及有害性，为衰老过程中线粒体功能下降的原因提供了一种新的机制解释。这一研究也提示mtDNA突变及衍生的线粒体功能下降是衰老及相关疾病的重要基础，而降低细胞mtDNA突变积累可能有助于衰老及相关疾病的预防及治疗。论文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2201518120。

顾正龙教授作为国际知名遗传学家，其团队多年来致力于线粒体与疾病、基因组功能与进化、多基因调控网络的功能和进化等诸多领域的研究，在Nature、Nature Genetics、PNAS等国际顶级期刊发表文章逾60余篇，文章被引用总计超5000余次。

同期，受PNAS期刊邀请，顾正龙教授对在该期刊发表的文章Combination of common mtDNA variants results in mitochondrial dysfunction and a connective tissue dysregulation开展分析与评述，发表了题为“Incompatibilities between common mtDNA variants in human disease”的评述论文。  

文章总结指出：（1）常见的mtDNA变异，如果出现在不相容的mtDNA背景中也可导致线粒体功能障碍，这为解析线粒体相关疾病的发病机制提供了新的思方向；（2）线粒体功能障碍可引起细胞内多组学水平的显著改变，为今后研究线粒体mtDNA突变与细胞表型之间的关系提供了重要依据；（3）线粒体-核相互作用在改变细胞表型中至关重要，同时检测mtDNA和核DNA突变可更好地阐明线粒体相关疾病的病因；（4）该研究提示，一些以前未被认为是由线粒体缺陷引起的疾病，其病因很可能是线粒体DNA的变异。这些发现为研究者们进一步理解复杂疾病的病因提供了新的视角和新的见解。

粤港澳大湾区精准医学研究院（广州）资深研究员、复旦大学教授顾正龙为本文通讯作者，青年研究员濮伟霖为本文第一作者。

论文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2201518120。

顾正龙教授简介和团队招聘启事：

https://www.ipm-gba.org.cn/Index/news_details/id/233.html