科研进展丨顾正龙/张经纬团队合作开发通用型单细胞多组学分析平台

基于微孔板的建库流程已被用于单细胞分离和多组学分析。在典型的基于微孔板的单细胞基因组建库流程中，目标生物分子被转化为双链DNA中间体，然后通过Tn5转座酶进行片段标记。最后，通过双索引标记（dual index）引物扩增形成单细胞分辨率的测序文库。然而，这些工作流程具有繁琐、低细胞通量和试剂成本高等缺点。

近年来，液滴微流控已成为高通量单细胞文库构建的强大工具技术。以inDrops、Drop-seq、Microbe-seq、dscATAC-seq、CITE-seq和SNARE-seq为代表的低成本液滴技术使生物学家能够高通量对单细胞进行深入分析。然而，尽管将文库构建反应从微孔板形式转变为液滴形式已取得了一些激动人心的发展，但将基于微孔板的单细胞基因组文库构建流程转变为基于液滴的形式仍然面临着重大挑战。这是因为该类建库流程具有多步反应特性，通常涉及不同反应试剂和酶促反应步骤。尽管微流控操作如液滴合并可允许多种试剂添加，但试剂的兼容性和有效的添加顺序仍然很难实现，特别是建库流程中存在纯化步骤时，整个工作流程很难有效进行。与传统的液滴相比，微孔板具有两个优势点：1.微孔板是一个开放系统，允许多步试剂添加、去除和缓冲液交换；2.微孔板具有物理隔离的反应孔，防止来自不同细胞的生物分子之间的交叉污染。

在该工作中，作者提出了用异质性聚合物形成微型反应器以包裹完整细胞进行单细胞分析的策略。该反应器具有相对流动的核心和类似细胞膜的外壳，这种三维结构具有多重功能：

1.在细胞裂解后，外壳可保持单个细胞组分的物理分离，防止线粒体DNA和细胞质内RNA等分子的交叉污染；

2.外壳具有可调节的渗透性，允许反应试剂和酶的交换；

3.相对流体核心提供了一个相对均匀的环境，有利于生化反应发生；

4.外壳的渗透性使得Tn5标签化反应和单细胞标签化反应可以有效进行。

基于上述策略作者开发了一种通用型单细胞多组学分析平台（HetHydrogel）。HetHydrogel重现了微孔板的大部分优点，包括具有开放性功能以进行反应试剂的交换和补充；具有物理隔离功能以进行单细胞分析。同时，HetHydrogel适配更小的反应体积（因此试剂成本更低）和简易的实验操作特点（从而实现了更高的分析通量）。作为初步探索，该研究展示了HetHydrogel在构建单细胞线粒体DNA和染色质开放性共测序文库中的优势。单个细胞被包裹在HetHydrogel中，随后进行细胞通透化反应，然后进行染色质开放区域和线粒体DNA的Tn5片段标记反应。在非变性条件下，Tn5转座酶通过其蛋白二聚体界面与标记的DNA片段连接在一起，防止片段化的DNA短片段的分离和扩散。与此同时，HetHydrogel在离心和洗涤步骤中提供必要的机械支撑，以保持HetHydrogel和DNA内容物的完整性。为了降低单细胞标签化反应中经典的双泊松分布问题，作者将HetHydrogel与多个小细胞条形码微珠（直径为10 µm）共包裹（由于Tn5标记的片段含随机边界序列，后续分析可以作为唯一的液滴标签，将来自同一液滴的多个细胞条形码微珠进行关联）。在进行单细胞标签化反应后，通过含测序接头PCR反应既可从同一细胞获得线粒体DNA和染色质开放性区域的测序文库。

HetHydrogel平台用于单细胞多组学分析示意图

综上，本研究介绍了一种新的微型反应器-HetHydrogel，用于高通量单细胞封装和分析。相比过去的许多尝试，如SPLiT-seq通过对细胞进行固定和通透化处理，将原生细胞膜转化为体外反应器。HetHydrogel用聚合物膜代替细胞膜，通过其独特的分层结构和渗透性工程特性对各种生物分子的通道进行精确控制来形成新型微反应器。回顾起来，与其将HetHydrogel视为微孔板的模拟物，不如将其视为细胞的模拟物（具有自己的“聚合物膜”和胶状核心）。未来，通过调整PEGDA的相对浓度和分子量，并确定合适的聚合物组成，将能够精确调节HetHydrogel外壳的孔径。本研究展示了单细胞水平上线粒体DNA和染色质可及性同时分析的潜能。展望未来，我们设想通过携带不同插入序列的Tn5进行标签化反应将无缝整合到逆转录反应中，从而实现以线粒体DNA突变检测为核心的高维度单细胞多组学文库构建。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/smtd.202470034 

Hot topic (Microfluidics)链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/toc/10.1002/(ISSN)2365-709X.hottopic-microfluidics